AF4是一种用于根据细胞外囊泡（如外泌体）的密度和流体动力学特性分离其不同子集的技术。

  透射电镜所涉及的原理与光学显微镜相似，然而TEM使用的电子波长比光的电子小。最佳分辨率远优于光学显微镜。众所周知，TEM是通过电子显微镜成像研究外泌体形态的金标准，因为外泌体尺寸小且易于样品制备。TEM具有1nm的分辨率，宽光束聚焦样品，负染色被认为是简单而快速的，持续2-3小时以产生二维图像。简而言之，首先将外泌体固定在2%w/v多聚甲醛中，沉积在碳涂层的Formvar网格上，并孵育20分钟。然后用磷酸盐缓冲盐水洗涤预涂的网格，并与戊二醛等交联剂孵育并用水洗涤。然后将外泌体囊泡用2%w/v乙酸铀酰溶液染色并风干。TEM可用于：确认溶液中外泌体的存在，研究囊泡的形态并评估外泌体的质量。由于TEM具有缺乏可重复性和效率低下等局限性，因此很少用于定量外泌体。外泌体表面标志物能够最终靠使用免疫电子显微镜进行鉴定和定量，它包括将外泌体囊泡与一抗和二抗结合在5至40 nm金颗粒上孵育，TEM报道了外泌体的杯形形态。

  所涉及的基本原理是SEM中的加速电子携带大量动能，当入射电子在固体样品中减速时，该能量作为电子-样品相互作用产生的各种信号消散。SEM中的样品扫描是使用细点光束逐行扫描的。在这里，SEM聚焦样品表面以获得外泌体的三维图像。简而言之，外泌体用戊二醛固定在碳涂层/铜网格上，并用乙醇脱水。使用溅射机风干并涂覆金，厚度范围为2至10nm。然后准备通过SEM分析样品。报告显示，外泌体的SEM成像是圆形的，外观呈凸起。

  冷冻电镜是一种TEM，其中典型的样品制备涉及低温以观察天然水环境。对于冷冻电镜分析，将液体悬浮外泌体放置在网格上，然后将其快速浸入液体乙烷中以使外泌体样品玻璃化。玻璃化过程后，样品可以直接通过冷冻电镜分析成像或转移到液氮中储存以进行进一步分析。冷冻电镜发现外泌体的形态是双层结构，有时被较小的囊泡包围。

  AFM使用带有非常锋利尖端的悬臂在样品表面上扫描。当尖端接近表面时，表面和尖端之间的近距离吸引力导致悬臂向表面偏转。AFM可用于检查高分辨率小于1nm的外泌体的形貌。简而言之，将外泌体囊泡悬浮液放置在云母底物上，并在室温下风干。然后将干燥的样品用超纯水洗涤，并在液氮气中干燥。在这里，硅探针用于在AFM下查看样品并使用软件进行分析。该技术可用于鉴定外泌体表面的特异性受点，例如，使用AFM的免疫金成像报告了外泌体上的多个CD63受点。

  NTA是通过捕获视频中颗粒的布朗运动来测量样品尺寸分布和浓度的最复杂方法之一。根据周围液体中大小颗粒的不同扩散运动，确定颗粒的流体动力学直径。与TEM和流式细胞术相比，NTA提供了更好且可重复的结果。NTA能够以高分辨率检测直径范围为30-1000nm的囊泡。其中涉及的基本原理是动态光散射原理以及使用斯托克斯-爱因斯坦方程来量化颗粒浓度和大小。根据配备488 nm激光器（英国马尔文马尔文 Panalytical）的 NanoSight NS300 用户手册，在散射设置下，每个样品通过注射泵以15的速度加载到机器中，相机级别设置为11，分析检测阈值为3。每个视频的持续时间为40秒，帧速率为25帧/秒。整个样品分析过程大约需要10-15分钟才能获得粒度分布和浓度的数据。NTA 3.2版软件用于录制和分析示例视频。所有这些分析都是在散射光或荧光模式下根据需要快速可靠地进行统计的。

  应用电泳光散射原理（粒子在外加电场中的运动）测量外泌体的zeta电位，以评估溶液状态下的囊泡稳定性。ZetaView设置将在NTA中用于zeta电位测量。对于NTA和zeta电位分析，样品将在PBS中以1：1000稀释，并在室温下涡旋/超声处理10分钟。

  AF4是一种用于根据细胞外囊泡（如外泌体）的密度和流体动力学特性分离其不同子集的技术。在这种技术中，外泌体被迫通过前向层流通道，并根据它们的布朗运动分选成不同的群体。较大的颗粒具有较低的扩散速率，并且往往移动得更慢。然而，较小的颗粒具有更高的扩散速率，并且往往移动得更快。已经报道了几项比较AF4和NTA进行外泌体分析的研究，AF4能够区分各种囊泡亚群。包括发现一种尺寸30纳米的新粒子，称为外泌体。但NTA已经显示出从50到150nm的单一宽峰。因此，AF4是解决外泌体表征的大小异质性的优越，先进的技术。

  RPS是一种根据电阻测量通过小孔的流体中单个囊泡大小的技术，RPS能够检测50–1000nm的囊泡尺寸范围。Spectradyne，LLC是胶体颗粒微流体测量领域的领先公司。与动态光散射和NTA技术相比，RPS在测量粒度分布方面具有更高的尺寸分辨率和更高的精度。通过RPS分析获得的相同样品的结果与TEM获得的计数密切相关。NTA无法将外泌体与脂质体，蛋白质聚集体和细菌区分开来，与RPS分析相比，浓度高出5至10倍。

  由于分辨率低，流式细胞术不是检测外泌体的可靠技术。一些研究已经报道，可以根据其表面标志物半定量检测尺寸范围为300-500nm的细胞外囊泡。简而言之，将外泌体与醛/硫酸盐-乳胶珠一起连续旋转孵育15分钟以进行反应。通过加入甘氨酸和牛血清白蛋白（BSA）溶液停止反应。外泌体结合的珠子用PBS洗涤并用BSA溶液封闭。对于特异性膜标志物检测，依次加入一抗和荧光标记的二抗。将外泌体结合珠与同种型对照孵育，然后孵育二抗或在没有一抗的情况下作为阴性对照。使用这种方法，与来自胰腺癌细胞的外泌体相比，来自非致瘤细胞的外泌体携带较少的glypican-1。

  Exo View是Nano View Biosciences的基于抗体的外泌体阵列。与流式细胞术技术相比，该技术能够以非常低的样品量分化外泌体亚群，并且耗时更少。将含有外泌体的外泌体样品或生物体液与芯片一起孵育过夜。孵育后，在摇床上用PBS冲洗切片并风干。捕获的外泌体使用单粒子干涉反射成像传感器技术进行鉴定。使用来自HEK 293细胞培养物的纯化外泌体的表征概念和外泌体表征的临床相关性直接从人脑脊液中得到证明。这种技术可以增强来自粒子的信号对比度。通过这种方法将针对外泌体表面标志物的抗体排列在硅芯片上。

  外泌体的体内跟踪可以利用几种方法来完成，例如用亲脂性羰花青染料标记外泌体，包括PKH67和PKH26（红色），另一种方法包括用绿色荧光蛋白（GFP）或mCherry标记外泌体标志物，如CD63细胞。使用IVIS光谱系统检测荧光标记外泌体在小鼠血液循环中的命运。